Статьи

13 августа 2012

Получение и оценка свойств рекомбинантного аналога мажорного аллергена пыльцы березы Betv1

Российский аллергологический журнал, №3, С.7-13, 2012.

А.Е. Павлов1,2, Н.А. Сейлиева1, О.Ю. Мухортых1, В.Е. Стефанов2. (1. ООО «Вега» Группа компаний Алкор Био, Санкт-

Петербург; 2. Санкт-Петербургский Государственный Университет, Санкт-Петербург.) 

Ключевые слова: аллергодиагностика, пыльца березы, рекомбинантный аллерген, Betv1.

Резюме

Цель работы Для широкого внедрения покомпонентной аллергодиагностики в лабораторную практику необходимо создать протоколы получения, очистки и верификации свойств синтетических аллергенов. Мажорный белок пыльцы березы Betv1, являющийся представителем суперсемейства PR-10, представляет значительный интерес благодаря высокой частоте случаев сенсибилизации и проявлением кросс-реактивных свойств.

Материалы и методы Для получения синтетического белка были применены методы клонирования ДНК с последующей экспрессией в культуре клеток E.coli. Очистка выполнена методом металл-аффинной хроматографии. Оценка иммунохимических свойств проведена в аллергосорбентном тесте, ИФА анализе и лайн-блоте.

Результаты В ходе данной работы нами был получен высокопродуктивный бактериальный штамм E.coli, содержащий экспрессионную конструкцию мажорного аллергена пыльцы березы - белок Betv1. Была произведена оценка его физико-химических и иммунологических свойств в различных тест-системах с использованием референсных препаратов и панели сывороток.

Заключение Показано, что полученный синтетический аналог белка Betv1 может быть использован для тестирования наличия специфических иммуноглобулинов класса Е в образцах сыворотки крови. Данный аллергенный компонент может быть применен для покомпонентной оценки профиля сенсибилизации пациента. 

1. Введение 

Специалисты в области аллергологии во всем мире отмечают быстрый рост числа людей, страдающих аллергическими заболеваниями. Особенно ярко эта динамика наблюдается в развитых странах [1].

Первым шагом к облегчению аллергических состояний и активной профилактики заболевания является выявление агента, вызывающего реакцию гиперчувствительности.   

Правильная постановка диагноза требует проведения целого комплекса мероприятий, который включает в себя последовательное исключение контактов с потенциальными аллергенами, кожные тесты и in vitro диагностика [2]. Данная клиническая практика сформировалась по причине комплексной природы аллергического ответа и невысокой специфичности каждого подхода в отдельности.  

Лабораторная in vitro диагностика специфической сенсибилизации состоит, как правило, в измерении уровней иммуноглобулинов класса Е (IgE) к специфическим антигенам по принципу иммунохимического анализа. Несмотря на уже почти полувековую историю аллергодиагностики in vitro, её результаты до сих пор носят для врачей-аллергологов скорее рекомендательный характер.

Причиной тому невысокая специфичность анализа и наличие расхождений с результатами кожных проб [3]. Одним из источников этой проблемы является применение в диагностических тест-системах компонентов, полученных из  натуральных, природных источников. Экстракты аллергенов плохо поддаются стандартизации из-за их естественной вариабельности в природных источниках и многостадийного процесса получения. Белки, вызывающие аллергические реакции, могут быть выделены различным способом и из разнообразного материала (пыльца, фрукты, шерсть животных и т. п.), но иметь сходную структуру, обусловленную эволюционной консервативностью их функций [4].

С развитием техники молекулярного клонирования и рекомбинантных технологий, была начата интенсивная работа по поиску белковых компонентов, обуславливающих аллергенность различных веществ, для получения синтетических аналогов. Данные белки могут быть использованы для детальной оценки профиля чувствительности пациента к конкретному аллергену, а также проведения аллергоспецифической иммунной терапии (АСИТ). Замещение натуральных экстрактов на панели рекомбинантных аллергенных компонентов приведет к улучшению аналитических параметров тест-систем и может вывести in vitro аллергодиагностику на качественно новый уровень [7,8].

За два последних десятилетия описано несколько белковых суперсемейств, представителей которых можно обнаружить в целом спектре природных источников. Так, большой интерес представляет мажорный аллерген пыльцы березы – Betv1, который относится к суперсемейству PR-10 (pathogenesis related protein). Данный белок обуславливает развитие специфической сенсибилизации более чем у 95% пациентов страдающих от аллергии на пыльцу березы [5], которая, в свою очередь, является одной из самых распространенных причин развития ингаляционных форм аллергии. Белки суперсемейства PR-10 можно обнаружить в таких природных источниках как пыльца березы, пыльца лещины, яблоко, персик, морковь, арахис, соя, киви, сельдерей. Высокая гомологичность белков обуславливает их значительное иммуногенное сходство, что является причиной проявления иммунологической кросс-реактивности аллергенов различной природы [6].

Таким образом, существует необходимость разработки технологии получения и очистки синтетической формы мажорного аллергена пыльцы березы Betv1 и валидации ее иммунологических свойств для применения в диагностических тест-системах.К настоящему моменту было идентифицировано более 30 изоформ белка Betv1 [9], имеющих высокую степень гомологии. Масс-спектрометрическая оценка нативного варианта белка не выявила наличия пост-трансляционных модификаций, таких как гликозилирование и дезамидирование [10].

В рамках данного исследования была создана высокоэффективная экспрессионная конструкция, оптимизированы протоколы очистки белка, изучены условия перевода белка в растворимую форму, подобраны условия биотинилирования и лиофилизации, проведена серия экспериментов по оценке физико-химических и иммунологических свойств белка в различных системах. 

2. Материалы и методы 

1.    Клонирование, экспрессия и очистка

Клонирование

Генетическая конструкция, содержащая оптимизированную последовательность для гетерологичной экспрессии белка Betv1А (P15494, Uniprot) в бактериальной системе,  рестрикционные сайты и His-tag, была синтезирована компанией GenScript. Полученная ДНК была переклонирована в экспрессионный вектор pQE-30 (Qiagen), содержащий T5 промотер, под регуляцией lac-оперонов  и имеющий ген устойчивости к ампициллину. Правильность ориентации конструкции в векторе была подтверждена проведением полимеразной цепной реакции с внутренним праймером.

Экспрессия

Трансформация экспрессионной конструкции была выполнена в подготовленные электрокомпетентные клетки E.coli штамма M15[pREP4] (Qiagen). Отбор клонов был произведен на селективной среде с ампициллином.Клетки M15 pQE30[Betv1] растили в среде Luria Broth (LB) на 37°С, содержащей 100 мкг/мл ампициллина.

Экспрессия белка была индуцирована добавлением изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) (AppliChem) до концентрации 0,5 мМ после достижения оптической плотности культуры 0,8 при длине волны - 600нм. Появление и накопление рекомбинантного белка в лизате клеток контролировалось электрофоретически в акриламидном геле в денатурирующих условиях (ПААГ) [11].

После 4 часовой индукции клетки были сконцентрированы центрифугированием и подвергнуты ультразвуковой обработке на холоду (Bandelin Sonopuls 3100). Полученный лизат отцентрифугирован на 10000хg в течении 10 минут для разделения растворенного и нерастворенного компонентов. Обе фракции были проанализированы в ПААГ.Осадок лизата, содержащий синтезированный белок, был растворен в Трис-буфере (50 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, pH=8,0) с присутствием 8M мочевины.

Очистка

Очистка белка производилась методом жидкостной хроматографии (FPLC, AKTA Explorer, Pharmacia) на аффинной колонке с Ni-NTA сефарозой (His-trap, GE Health Care) в денатурирующих условиях. Элюция проводилась 500 мМ имидазолом и контролировалась спектрофотометрически при длине волны 280 нм.  

2.    Гель-электрофорез

Анализ состава фракций, а также степень очистки белка были произведены электрофоретически в 15% ПААГ и окрашен Coomassie R-250. Фракции, содержащие наибольшие количества чистого препарата были объединены. 

3.    Иммуноблот

Для оценки иммунологических свойств полученного препарата осадок клеточного лизата и очищенные фракции белка были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану при помощи прибора для полусухого переноса (Semi-dry, Хеликон). Параметры тока установлены из расчета 2 mA на 1 см2 мембраны, перенос проводили в течение 45 минут. После переноса полоски нитроцеллюлозной мембраны были прогибридизованы по схеме антиген - специфические антитела - конъюгат антивидового anti-IgE антитела с пероксидазой хрена. В качестве антисыворотки были использованы положительные пулированные образцы с уровнем специфических антител к пыльце березы не ниже 3-его класса. Образцы в разведении 1:50 инкубировали при +4°С в течение 16 часов. Пероксидазная активность выявлялась с использованием преципитирующего субстрата TMB-M (Sigma-Aldrich). 

4.    Аллергосорбентный тест

Сыворотки

Изучение иммунологических свойств синтетического белка было выполнено на индивидуальных сыворотках крови 18 пациентов (в возрасте от 2 до 17 лет). Диагноз аллергия на пыльцу березы был поставлен на основе данных анамнеза, положительном результате кожного теста с использованием экстракта пыльцы березы (ФГУП НПО «Микроген», Ставрополь) и повышенным уровнем специфического IgE к пыльце березы, оцененным при помощи анализатора ImmunoCAP 250 (препарат t3, Phadia). 

Контрольные сыворотки были получены от 5 здоровых пациентов, с низким уровнем общего IgE (тест система «ИФА-общий IgE», Алкор Био) и не имеющих специфических IgE к пыльце березы (ImmunoCAP 250, препарат t3, Phadia).  Рекомбинантный белок Betv1 в концентрациях 80, 8, 0,8 мкг/мл (50 мМ Трис-HCl с 0,5М мочевиной) и аллерген экстракта березы (Алкор Био) в концентрации 50 мкг/мл (50 мМ Трис-HCl) были сорбированы на фазу микропланшета (Nunc Maxisorb) при +4°С в течение 16 часов. После ночной сорбции и последующей отмывки, проводили инкубацию лунок микропланшета с положительными сыворотками и контрольными образцами в разведении 1:10. Наличие специфического сигнала выявляли после инкубации с конъюгатом анти-IgE пероксидаза хрена (anti IgE-HRP, Hitachi) и растворимым субстратом ТМБ (Алкор Био). Реакцию останавливали добавлением 0,1М HCl. Оптическую плотность измеряли на планшетном фотометре Multiscan FC (Thermo Fisher Scientific) при длине волны 450 нм. 

5.    Перевод в растворимую форму

Для перевода белка в растворимую форму и последующего биотинилирования было использовано несколько вариантов диализа:

1)    Последовательный ступенчатый перевод из 8М мочевины в буфер, содержащий 50мМ Трис-HCl, 1мМ ЭДТА, 150мМ NaCl, 0,3М аргинин, pH=8,0 через аналогичные буферы, содержащие 4М, 2М и 0,5М мочевину.

Диализ проводили при 100х избытке буфера над образцом в течение 3 часов для каждой ступени.

2)    Диализ из 8М мочевины напрямую в 20мМ раствор бикарбоната натрия pH=11,2.

Диализ проводили при 100х избытке буфера над образцом 16 часов при +4°С.

Эффективность перевода белка в безмочевинные буферы контролировалась визуально и с последующей оценкой концентрации в ПААГ.   

6.    Биотинилирование

Для проверки возможности замены биотинилированной формы аллергена березы в «capture» варианте in vitro теста на синтетический аллергенный компонент было проведено биотинилирование рекомбинантного белка Betv1. Для модификации был использован гидроксисукцинимидный эфир биотина (Sigma) в десятикратном молярном избытке. Очистку биотинилированного аллергена от избытка свободного реагента производили на хроматографической колонке HiTrap G-25 (FPLC, AKTA Explorer, Pharmacia). Измерение уровня включения биотина в белок было выполнено с использованием комплекта реагентов Pierce Biotin Quantitation Kit (Pierce Biotechnology, Inc.). 

7.    Иммуноферментный анализ

Биотинилированный рекомбинантный аллерген Betv1A тестировали в наборе «АллергоИФА-специфический IgE» (Алкор Био) в концентрации 5мг/мл.  Всего проанализировано 24 сыворотки и проведено сравнение с препаратом биотинилированного экстракта березы (t3 береза бородавчатая, Алкор Био).  

8.    Лайн-блот

Оценка иммунологической активности синтетического аллергена по сравнению с референсными препаратами была проведена в лайн-блот анализе.

Белковые препараты экстракта пыльцы березы (0,5 мг/мл в фосфатно-солевом буфере, Алкор Био), референсного рекомбинантного аллергена Betv1 (Biomay, 20 мкг/мл в воде) и исследуемого синтетического аллергена Betv1A (0,2 мг/мл в 20 мМ Na2CO3) были нанесены в линиях на нитроцеллюлозную мембрану (0,2 мкм, BioRad) с использованием диспенсера IsoFlowTM Dispenser (Imagene Technology, Inc.).

После высушивания мембрану блокировали 3% раствором бычьего сывороточного альбумина и нарезали на полоски для последующей инкубации в индивидуальных ванночках.

Образцы инкубировали со специфическими и контрольными сыворотками (27 сывороток  в разведении 1:50), а также с буфером без сыворотки при +4°С в течение 16 часов.

Наличие специфического сигнала выявляли после инкубации с конъюгатом анти-IgE пероксидаза хрена (anti IgE-HRP, Hitachi) преципетирующим субстратом TMB-M (Sigma-Aldrich). Оценку уровней интенсивности сигнала определяли визуально по 5-ти бальной шкале. 

9.    Лиофилизация

Было проведено изучение стабильности препарата после лиофилизации. Раствор белка Betv1 (2 мг/мл) в 20мМ бикарбонатном буфере pH=11,2 делили на аликвоты, замораживали в жидком азоте и высушивали в лиофильной сушилке (Alpha Martin Ghrist) в течение 18 часов.

Сухой препарат восстанавливали деионизованной водой, концентрация измерена электрофоретически, проведена оценка сохранения антигенных свойств в лайн-блот анализе.

3. Результаты и обсуждение

1. Экспрессия и очистка

Синтетическая генная конструкция Betv1A была клонирована в вектор pQE-30 и экспрессирована в трансформированном штамме E.coli M15[pREP4]. Спустя 4 часа после индукции ИПТГ клетки были сконцентрированы и лизированы. Электрофорез в денатурирующих условиях показал высокую продуктивность клона и накопление рекомбинантного белка в нерастворимой форме. Средняя продуктивность культуры составила около 80 мкг белка на 1 мл культуры.

После растворения белка в буфере с хаотропным агентом была проведена очистка на металл-аффинной колонке.

Элюция имидазолом и последующий электрофоретический анализ фракций показал наличие чистого препарата в высокой концентрации и ожидаемым молекулярным весом ≈ 16 кДа (рис.1, №1-5). 

 

Рис. 1. ПААГ 12%. Окраска Coomassie.М – маркер молекулярного веса LMW.Культуры клеток E.coli M15[pREP4]: 1 – супернатант до индукции; 2 – нерастворимый осадок до индукции; 3 – супернатант после индукции; 4 – нерастворимый осадок после индукции.5 – экспрессированный белок после хроматографической очистки.6 – иммуноблот нерастворимого осадка культуры до индукции.7 – иммуноблот нерастворимого осадка культуры после индукции.8 – иммуноблот препарата экстракт березы (t3, Алкор Био). 

2. Иммуноблот

Первичная оценка иммунологических свойств синтетического аллергена была выполнена методом иммунного блоттинга. В качестве положительного контроля был использован препарат экстракта пыльцы березы (Алкор Био) и рекомбинантный аллерген Betv1 (BioMay). Показано, что положительная пулированная сыворотка пациентов с чувствительностью к пыльце березы специфически реагирует как с природным экстрактом, так и рекомбинантным белком (рис.1, № 6-8). Инкубация с отрицательным пулом не приводит к развитию специфической окраски. 

3. Растворимость

Для перевода белка в растворимую форму нами было использовано 2 подхода – ступенчатый диализ в растворах с понижением хаотропного агента в присутствии аргинина и резкий перевод раствора белка в буфер с высоким значением pH.Оба подхода показали одинаковую эффективность. Доля растворенного белка в буферах без хаотропного агента в обоих случаях идентична (оценка произведена электрофоретически). При меньших трудозатратах второй способ был признан предпочтительным. 

4. Оценка иммунохимических свойств.

Аллергосорбентный тест

В ходе проведенного анализа в формате аллергосорбентного теста была показана 100% специфичность результатов при параллельной постановке экстракта и синтетического белка на выборке индивидуальных пациентов. Более точная оценка корреляции классов сенсибилизации для положительных сывороток при применении различных препаратов была выполнена в «capture» и лайн-блот вариантах теста.

«Capture» формат ИФА анализа

Для использования синтетического аллергена в стандартной диагностической тест-системе в формате «capture» ИФА было проведено биотинилирование белка. Модификация синтетического аллергена Betv1 была выполнена в молярном соотношении белка и функционализирующего агента 1:10. Уровень включения составил 2,1 единиц биотина на молекулу белка. Изучение иммунологической активности биотинилированной формы белка Betv1 и сопоставление с экстрактом (t3, береза бородавчатая) было выполнено в тест-системе «АллергоИФА-специфический IgE» (Алкор Био). Для проведения анализа была взята выборка из 17 положительных сывороток, в диапазоне классов чувствительности от 2-ого до 5-ого и 16 отрицательных образцов.

Проведенный анализ показал полное совпадение результатов по отрицательным образцам и  незначительные расхождения среди положительных, но не более одного класса в 20% сывороток.

Лайн-блот

Для проведения исследований иммунохимических свойств Betv1 на объемной выборке индивидуальных сывороток пациентов был использован метод лайн-блот. Были проведены параллельные исследования 27 образцов, охарактеризованных в тест системе ImmunoCAP 250 (препарат экстракта пыльцы березы t3 и аллергенного компонента Betv1 t215, Phadia), определены их классы. При сопоставлении с результатами анализа сывороток в лайн-блоте на препаратах - экстракт пыльцы березы (Алкор Био), синтетическом белке Betv1 (Biomay) и исследуемого рекомбинантного аллергена, была выявлена высокая корреляция результатов анализа на всех препаратах для высоких классов сенсибилизации (выше четвертого). При уровнях специфических иммуноглобулинов характерных для 1-3 классов наблюдались незначительные расхождения (в пределах одного класса) при сопоставлении результатов референсного метода (t215, Phadia) и исследуемого белка. Синтетический белок Betv1 от производителя Biomay показал значительно более низкую чувствительность во всем диапазоне измерений. 

5. Лиофилизация

Лиофилизированная форма препарата полностью восстанавливалась после добавления воды и сохраняла свою изначальную концентрацию и иммунологическую активность.  

4. Заключение

Таким образом, в результате данной работы был получен высокопродуктивный бактериальный штамм E.coli, несущий экспрессионную конструкцию белка Betv1. Была отработана методика получения и очистки синтетического аллергена. Произведена оценка его физико-химических и иммунологических свойств. Проведено сравнение антигенных свойств аллергена в различных тест-системах с использованием референсных препаратов и панели сывороток, охарактеризованных по «золотому» стандарту (ImmunoCAP 250, Phadia). Показана стабильность лиофилизованной формы препарата. 

5. Применимость

Показано, что рекомбинантная форма мажорного аллергенного белка пыльцы березы Betv1 может быть использована для тестирования наличия специфических иммуноглобулинов класса Е в образцах сыворотки крови, как в аллергосорбентом тесте, так и в распространенном «capture» варианте анализа.

Внедрение практики применения аллергенных компонентов в лабораторной in vitro аллергодиагностике будет способствовать повышению специфичности и воспроизводимости проводимых анализов. 

6. Литература

1. Madsen C. Prevalence of food allergy: an overview. Proc. Nutr. Soc., 2005, v. 64, p. 413-417.

2. Ebo D.G., Hagendorens M.M., Bridts C.H., Stevens W.J. In vitro diagnosis of IgE-mediated allergy: breakthroughs in the last decade. Expert. Rev. Clin. Immunol., 2012, v. 8, p. 9-11.

3. Eriksson N.E., Ahlstedt S. Diagnosis of reaginic allergy with house dust, animal dander and pollen allergens in adult patients. V. A comparison between the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), provocation tests, skin tests and RAST. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 1977, v. 54, p.88-95.

4. Dolen W.K. Allergen extract standardization: reality, myth, or dream? Ann. Allergy Asthma Immunol., 1995, v. 75, p. 81-82.

5. Ipsen H., Løwenstein H. Isolation and immunochemical characterization of the major allergen of birch pollen (Betula verrucosa). J. Allergy Clin. Immunol., 1983, v. 72, p. 150-159.

6. Midoro-Horiuti T., Brooks E.G., Goldblum R.M. Pathogenesis-related proteins of plants as allergens. Ann. Allergy Asthma Immunol., 2001,v. 87, p. 261-271.

7. Asturias J.A., Ibarrola I., Amat P. et al. Purified allergens vs. complete extract in the diagnosis of plane tree pollen allergy. Clin. Exp. Allergy., 2006, v. 36, p. 1505-1512.

8. А. Е. Павлов, Н. А. Сейлиева, В. Е. Стефанов. Перспективы развития молекулярной диагностики аллергии в формате микрочипа. Клиническая лабораторная диагностика, 2011, №12, с. 3-7. 

9. WHO/IUIS Allergen Nomenclature Sub-committee: [www.allergen.org]. URL: http://www.allergen.org/

10. Swoboda I., Jilek A., Ferreira F. et al. Isoforms of Bet v 1, the major birch pollen allergen, analyzed by liquid chromatography, mass spectrometry and cDNA cloning. J. Biol. Chem., 1995, v. 270, p. 2607–2613.11. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, Aug 15; 227(5259):680-5.