Статьи

01 ноября 2011

Новые возможности количественного определения поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) в сыворотке и плазме крови с использованием тест-системы российского производства

Статья опубликована: Справочник заведующего КДЛ №8, август 2011

Мукомолов С. Л.1, Иванова Н.В.1, Мукомолова А.Л.2 , Ермолина В.В.1

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург

2 ФГУ «ФЦСКЭ имени В.А. Алмазова Росмедтехнологий», Санкт-Петербург 

   С момента открытия B.Blumberg в 1964 г [4] поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), определение этого вирусного белка в сыворотке крови является определяющим лабораторным критерием в диагностике гепатита В (ГВ) [2]. Еще в 80-х годах прошлого века была отмечена корреляционная связь между титром HBsAg, обнаружением в сыворотке крови HBeAg – антигена вируса ГВ, ассоциирующегося с вирусной репродукцией, и выраженностью патологических изменений в ткани печени [1]. Поэтому уже в то время уделялось внимание определению титра HBsAg в клинической практике.

   Инновацией в области определения маркеров ГВ явилась разработка в начале 2000-х годов компанией Abbott Laboratories (США)  стандартизованного хемилюминесцентного теста, позволяющего измерять количество поверхностного  антигена ГВ в международных единицах [8]. Несколько позже подобный тест разработала и Швейцарская компания Roche Diagnostics [14]. Исследования, проведенные в различных странах, показали широкое варьирование количественных характеристик HBsAg у пациентов с хронической ГВ инфекцией в процессе естественного развития и достаточно сильную корреляцию между уровнями поверхностного антигена, обнаружением HBeAg и уровнем ДНК вируса ГВ в крови [7, 9, 10, 12, 15, 16].

   Современная практика исследований маркеров ГВ показала, что предпочтительным маркером при мониторинге течения хронического ГВ и его терапии является количественное определение HBsAg. Установлено значительное снижение уровней поверхностного антигена при сероконверсии HBeAg в anti-HBe, что является одним из критериев успешности терапии [3, 5, 6, 13, 17, 18].

   Таким образом, широкое использование количественного определения HBsAg у пациентов с ГВ может оказаться весьма полезным для прогноза естественного течения инфекции и оценки эффективности лечения.

   Стоит отметить, что наряду с зарубежными тестами для количественного определения HBsAg, теперь на российском рынке есть новый продукт, который, несомненно, будет способствовать решению указанных задач – набор реагентов «ГепатитИФА-HBsAg», разработанный компанией «Алкор Био» (Санкт-Петербург, Россия).  Уникальностью данной тест-системы является возможность ее использования как для качественного, так и для количественного определения HBsAg в сыворотке и плазме крови человека методом иммуноферментного анализа (ИФА)

   На базе НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург были проведены клинические испытания новой тест-системы «ГепатитИФА-HBsAg», в рамках которых проводилась оценка чувствительности и специфичности набора.

Материалы и методы

Тест-системы

Набор реагентов «ГепатитИФА-HBsAg» предназначен для качественного и количественного определения HBsAg в сыворотке и плазме крови человека.

В наборе «ГепатитИФА-HBsAg» реализован «сэндвич»-вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для этого использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к HBsAg. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена. В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-HBsAg-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация HBsAg, содержащегося в исследуемом образце, и связывание его с конъюгатом. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-HBsAg-пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации HBsAg. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству HBsAg в исследуемом образце.

         Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна концентрации HBsAg в анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках, на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация HBsAg в исследуемых образцах.

         Коммерческая тест-система для количественного определения HBsAg методом хемилюминисцентного анализа (ХЛА) «ARCHITECT HBsAg» производства Abbott Laboratories (США) использовалась в качестве референтной.

         Исследование сывороток проводили согласно инструкциям по применению фирм изготовителей наборов «ARCHITECT HBsAg» и «ГепатитИФА-HBsAg». Измерение концентрации HBsAg в пробах проводилось параллельно на двух тест-системах.

Исследуемые сыворотки

Оценка результатов количественного определения HBsAg проводилась на панели сывороток, состоящей из 80 положительных (содержащих HBsAg) и 80 отрицательных (не содержащих HBsAg) образцов. Все сыворотки этой панели были отобраны из числа предварительно исследованных на содержание HBsAg в ИФА с использованием тест-систем «HBsAg-ИФА-Бест» (Вектор Бест, Новосибирская обл.) и «ImmunoComb II HBsAg 90» (Orgenics, Израиль) при обследовании пациентов с различными формами гепатита В.  До настоящего тестирования образцы хранились в условиях глубокого холода при -85ºС и размораживались непосредственно перед исследованием.

Оборудование

Регистрация результатов ИФА проводилось на  спектрофотометре вертикального сканирования BioRad 680 (BioRad, США), а ХЛА – на хемилюминисцентном автоматическом анализаторе ARCHITECT I-1000SR (Abbott Laboratories, США).

При анализе полученных данных оценивалось соответствие результатов, полученных с помощью наборов «ГепатитИФА-HBsAg» и  «ARCHITECT HBsAg».

Результаты и обсуждение

В результате проведенных исследований, все 80 HBsAg-позитивных образцов исследуемой панели оказались позитивными в ХЛА («ARCHITECT HBsAg»). Из 80 тестированных положительных образцов, в которых обнаружение HBsAg подтверждено в ХЛА референтной тест-системе, сравниваемая тест-система «ГепатитИФА-HBsAg» производства компании «Алкор Био» обнаружила HBsAg во всех 80 образцах.

Из  80 тестированных HBsAg-отрицательных образцов, в которых также не обнаружен HBsAg с помощью референтного набора «ARCHITECT HBsAg», испытуемая тест-система «ГепатитИФА-HBsAg»  не обнаружила HBsAg ни в одном образце.

Таким образом, в настоящем исследовании установлено:

·      число «истинно положительных» результатов – 80;

·      число «ложно отрицательных» результатов – 0;

·      число «истинно отрицательных» результатов – 80;

·      число «ложно положительных» результатов – 0. 

Чувствительность тест-системы, рассчитанная по формуле (1)  составила  100 %.

Число «истинно положительных» образцовх100%      (1)
Число «истинно положительных» образцов  +Число «ложно отрицательных» образцов
    
 Специфичность тест-системы также составила 100% и рассчитывалась по формуле (2):
Число «истинно отрицательных» образцовх100%    (2)
Число «истинно отрицательных» образцов  +Число «ложно положительных» образцов
    
 

При сравнении количественного уровня HBsAg в исследуемых образцах установлены сопоставимые показатели, полученные в обеих тест-системах, при коэффициенте корреляции r = 0,99. В качестве примера в таблице 1 суммированы результаты измерения количества HBsAg в низкотитражных образцах испытуемой панели.

 

Таблица 1 Результаты измерения количественного содержания поверхностного антигена вируса ГВ в образцах испытуемой панели сывороток с низким содержанием антигена

№ образца

Концентрация HBsAg в МЕ/мл

ARCHITECT HBsAg

«ГепатитИФА-HBsAg»

8334,942,0
910,981,2
9814,317,0
10158,065,0
10233,029,0
10716,016,0
10916,618,0
11910,18,0
 

Выводы

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

Разработанная тест-система «ГепатитИФА-HBsAg» для качественного и количественного определения HBsAg обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Количественное содержание HBsAg в исследованных образцах совпали при тестировании в испытуемой и референтной тест-системах и показали высокую корреляцию данных (r = 0,99).

Таким образом, тест-система  «ГепатитИФА-HBsAg» производства компании «Алкор Био» может быть рекомендована для широкого применения в клинической практике как для проведения скрининговых исследований, так и для мониторинга лечения и глубокого изучения естественного течения гепатита В.

 Литература
  1. Мукомолов С.Л. Эпидемиологическая и клинико-лабораторная  характеристика хронических носителей  HBsAg в зависимости от выраженности патологического процесса.// Автореф. дисс. канд. мед. наук Л. 1984. – 24 с.
  2. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). – М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003. – 384 с.
  3. Andersson K.L., Chung R.T. Monitoring during and after antiviral therapy for hepatitis B.// Hepatology. – 2009. – vol. 49. – p. 166-173
  4. Blumberg B.S., Alter H.J., Visnich S.A. A “New” antigen in leukemia sera.// JAMA. – 1984. – vol. 252, N2. – p. 352-257
  5. Brunetto M.R., Moriconi F., Bonino F. et al. Hepatitis B virus surface antigen levels: a guide to sustained response to peginterferon alfa-2a in HBeAg-negative chronic hepatitis B.// Hepatology. – 2009. – vol. 49, N4. – p. 1141-1150
  6. Chan H.L., Wong V.W., Tse A.M. et al. Serum hepatitis B surface antigen quantification can reflect hepatitis B virus in the liver and predict treatment response.// Clin. Gastroenterol. Hepatol. – 2007. – vol. 5, N12. – p. 1462-1468
  7. Chan H.L., Wong V.W., Wong G.L. et al. A longitudinal study on the natural history of serum hepatitis B surface antigen changes in chronic hepatitis B.// Hepatology. – 2010. – vol. 52, N4. – p. 1232-1241
  8. Deguchi M., Yamashita N., Kagita M. et al. Quantitation of hepatitis B surface antigen by an automated chemiluminiscent microparticle immunoassay.// J. Virol. Methods. – 2004. – vol. 115. – p. 217-222
  9. Jaroszewicz J., Calle Serrano B., Wursthorn K. et al. Hepatitis B surface antigen (HBsAg) levels in the natural history of hepatitis B virus (HBV) – infection: a European perspective.// J.Hepatol. – 2010. – vol.52, N4. – p.514-522
  10. Kim Y.J., Cho H.C., Choi M.S. et al. The change of the quantitative HbsAg level during the natural course of chronic hepatitis B.// Liver Int. – 2011. – vol. 31, N6. – p. 819-825
  11. Lee J.M., Ahn S.H. Quantification of HBsAg: Basic virology for clinical practice. // World J. Gastroenterol. – 2011. – vol. 17, N3. – p. 283-289
  12. Lee J.H., Kim S.J., Ahn S.H. et al. Correlation between quantitative serum HBsAg and HBV DNA test in Korean patients who showed high level of HBsAg.// J. Clin. Pathol. – 2010. – vol. 63, N 11. – p. 1027-1031
  13. Lee M.H., Lee da M., Kim S.S. et al. Correlation of serum hepatitis B surface antigen level with response to entecavir in naive patients with chronic hepatitis B.// J. Med. Virol. – 2011. – vol. 83., N7. – p.1178-1186
  14.  Muhlbacher A., Weber B., Burgisser P. et al. Multicenter study of a new fully automated HBsAg screening assay with enhanced sensitivity for the detection of HBV mutants.// Med. Microbiol. Immunol. – 2008. vol. 197. – p. 55-64
  15. Nguyen T., Thompson A.J., Bowden S. et al. Hepatitis B surface antigen levels during the natural history of chronic hepatitis B: a perspective on Asia.// J.Hepatol. – 2010. – vol.52, N4. – p. 508-513
  16. Su T.H., Hsu C.S., Chen C.L. et al. Serum hepatitis B surface antigen concentration correlates with HBV DNA level in patients with chronic hepatitis B.// Antivir. Ther. – 2010. – vol. 15, N8. – p. 1133-1139
  17. Tangkijvanich P., Komolmit P., Mahachai V. et al. Comparison between quantitative hepatitis B surface antigen, hepatitis B e-antigen and hepatitis B virus DNA level for predicting virological response to pegilated interferon-alpha-2b therapy in hepatitis B e-antigen-positive chronic hepatitis B.// Hepatol.Res. – 2010. – vol.40, N4. – p.269-277
  18. Wang X.Y., Zhang X.X., Yao X. et al. Serum HbeAg sero-conversion correlated with decrease of HbsAg and HBV DNA in chronic hepatitis B patients treated with a therapeutic vaccine.// Vaccine. – 2010. – vol. 28, N5. – p. 8169-8174