Журнал"Лаборатория"№4,2012,с.26-27

О.В.Аак, канд.хим.наук, ведущ.науч.сотр.

А.В.Соболев, д-р мед.наук, профессор.

НИИ медицинской микологии имени П.Н. Кашкина Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова 

Распространенность аллергических заболеваний имеет ярко выраженную тенденцию к росту, что отчетливо прослеживается повсеместно и для большинства нозологических форм аллергии, включая атопические варианты течения. Наиболее убедительные данные были получены во время проведения III национального обследования здоровья и питания в США (1988-1994 г.г.) при комплексном исследовании, включающем постановку кожных проб к 10 распространенным аллергенам у более  чем 30 тыс. случайно выбранных человек, проживающих в разных регионах страны. Оказалось, что больше половины обследованных американцев страдают атопической формой аллергии. Сравнение с результатами предыдущего обследования (1976-1980 г.г.) показало увеличение частоты сенсибилизации к распространенным аллергенам от 2,1 до 5,5 раз [1]. При проведении аллергологического обследования важно определить возможные механизмы развития аллергической реакции. В зависимости от варианта течения аллергии подбирается тактика лечения. Особое значение уделяется выявлению больных с атопическим вариантом аллергии. Именно у этой группы пациентов возможно проведение аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ), которая позволяет снизить чувствительность к аллергенам и уменьшить риск развития поливалентной аллергии. Для решения этой задачи  требуется проведение аллергообследования с определением уровня специфических IgE (sIgE) к причинно-значимым аллергенам.

В настоящее время большинство анализов на sIgE выполняются методом иммуноферментного анализа (ИФА). Компоненты тест-систем, такие как высокоактивные ферментные метки (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза), их субстраты для фото-, люмино- и флуорометрической детекции, целлюлозные и полимерные фазы для создания иммуносорбентов, а также пара биотин-авидин (стрептавидин) были разработаны и описаны до середины 90-х годов прошлого века. Поэтому, когда речь идет о диагностикумах 2 и 3 поколений, имеется в виду автоматизация, ускорение и стандартизация анализа, повышение его чувствительности и специфичности. Первый анализ sIgE был выполнен радиоаллергосорбентным методом в 1972 г. (Phadebas IgE Test), при этом использовались бумажные диски с иммобилизованными аллергенами. Первый вариант «обращенного» ИФА (REAST) sIgE был описан испанскими авторами в 1983 г. [2]. Было предложено улавливать из анализируемой пробы все IgE, а sIgE затем проявлять конъюгатами пероксидазы с аллергенами. В 1986 г. метод был универсализирован применением общего для всех аллергенов проявляющего реагента – конъюгата стрептавидин-пероксидаза, аллергены же модифицировались биотинилированием [3]. Это удлиняло ИФА на одну стадию, но оказалось возможным сократить продолжительность анализа путем преформированния в растворе иммунных комплексов аллерген-sIgE и IgE-биоанти-IgE. Термин «обращенный» был использован авторами, чтобы подчеркнуть отличие от аллергосорбентного ИФА с иммобилизованными на твердой фазе аллергенами. Поскольку на первой стадии происходит извлечение из пробы sIgE иммобилизованными на твердой фазе улавливающими антителами, то метод можно было бы назвать ИФА с использованием улавливающих антител. В настоящее время эта методика получила название реверсивный или «capture»-вариант ИФА.В аллергосорбентном варианте ИФА нанесенные на твердую фазу экстракты аллергенов содержат палитру посторонних белков, гликопротеидов и полисахаридов. Это, во-первых, уменьшает специфическую сорбционную емкость аллергосорбентов, что снижает чувствительность анализа. Во-вторых, без должной предварительной обработки экстракта высока вероятность получения сорбента, обладающего и неспецифической емкостью, что приводит к частичной, а иногда и полной потере специфичности анализа. На специфичность аллергосорбентного метода могут оказывать негативное влияние высокие концентрации общего IgE и гемолиз при получении анализируемой сыворотки (только для пероксидазной метки). В отличие от аллергосорбентного варианта в «capture»-варианте ИФА иммуносорбент создан на основе антител к IgE (МАТ), что исключает перекрестные неспецифические реакции с иммуноглобулинами классов A, G, M и D и положительно влияет на специфичность. Так же важной особенностью «capture»-варианта иммуноферментного анализа является возможность использования серии калибраторов IgE для построения калибровочной кривой. Представление результатов не в балльной шкале, а  в виде цифрового значения концентрации позволяет сравнивать результаты, полученные в различных лабораториях и с использованием реагентов различных производителей, следить за эффективностью лечения и предсказывать возможность тех или иных клинических проявлений аллергии.            

«Capture»-вариант ИФА быстро завоевал популярность, в настоящее время ряд зарубежных фирм производят биотинилированные аллергены и другие реагенты для иммуноферментного анализа. В их числе ZenTech, Dr. Fooke, Allermetrix, Siemens Healthcare Diagnostics. В 2010 г. в их ряды вступил и «Алкор Био», выпустив набор реагентов «АллергоИФА-специфические IgE». В этой тест-системе исследование выполняется на полистироловых планшетах в стандартной технике иммуноферментного анализа и не требует специального оборудования. Анализ удобен для выполнения в разных клинических лабораториях независимо от их производительности. Достигается это использованием единого для всех аллергенов иммуносорбента – планшета, в лунках которого иммобилизованы анти-IgE антитела. Создание иммуносорбента на основе антител, а не препарата аллергена обеспечивает анализу гибкость, возможность формирования произвольного перечня аллергенов по показаниям врача, а также снижает неспецифические реакции. Аллерген же несет на себе биотиновую метку и проявляетcя на твердой фазе в составе иммунных комплексов со sIgE конъюгатом специфичного к биотину белка с пероксидазой хрена. Окончание анализа фотометрическое. Результаты регистрируются на любом вертикальном планшетном фотометре [4].

Мы приветствуем появление на отечественном рынке качественной и современной тест-системы для аллергодиагностики по приемлемым как для ДМС, так и ОМС ценам.

В течение двух последних лет в НИИ медицинской микологии имени П.Н. Кашкина проводится аллергологическое обследование больных с использованием тест систем компании «Алкор Био». В начале работы нами были проведены ограниченные испытания. Мы сравнивали наборы «АллергоИФА-специфические IgE» и биотинилированные аллергены к ним компании «Алкор Био» с MAST-CLA наборами компании «Hitachi Chemical Diagnostics». Для испытаний были взяты 6 отечественных биотинилированных аллергенов: береза бородавчатая (t3), полынь обыкновенная (w6), эпителий кошки (e1), домашняя пыль (h1), клещи Dermatophagoides pteronissinus (d1) и Dermatophagoides farina (d2). Каждый аллерген испытывали на 20 здоровых людях и 20 пациентах, страдающих тяжелыми формами атопических заболеваний. Средний возраст пациентов составил 28 лет, из них 54% –мужчины, 46% – женщины. Концентрация общего IgE в большинстве сывороток больных была высокой или очень высокой. По результатам испытаний был сделан вывод о высокой специфичности и хорошей чувствительности тест-системы «АллергоИФА-специфические IgE» компании «Алкор Био» и целесообразности её применения для выявления причинно значимых аллергенов [4].

Аллергодиагностика  является неотъемлемой частью при установлении возможных причин кашля и подборе методов лечения. Особую группу представляют больные, жалующиеся на длительный кашель и неэффективность от проводимого лечения. При лёгочной форме муковисцидоза кашель является одним из основных симптомов заболевания. В начальной стадии болезни кашель возникает в основном по утрам и сопровождается отхождением небольшого количества мокроты. Из-за повышенной вязкости мокроты отхождение её затруднено, что приводит к бактериальному воспалению, отёку и инфильтрации стенки бронхов. Больные муковисцидозом входят в группу риска по развитию аллергического бронхолёгочного аспергиллёза (АБЛА), особенно дети в возрасте до 10 лет с наличием полипозного риносинусита. Установление  у них выраженной сенсибилизации к грибам является очень важным и при удовлетворении не менее 6 критериев АБЛА (включая высокий  - более 417 МЕ/мл уровень общего IgE) требует назначения антимикотических препаратов.

Клинический пример 1.

Больной Б., 27 лет, находится под наблюдением в микологической клинике с диагнозом «Муковисцидоз, смешанная форма, средней степени тяжести, ремиссия. Вторичный хронический обструктивный бронхит, ремиссия. Двусторонние бронхоэктазы». Учитывая, что больной находится в группе риска по развитию АБЛА, проводилось аллергологическое (c использованием тест системы «АллергоИФА-специфические IgE») и микологическое обследование. По полученным данным в 2011 году уровень общего IgE составлял 237 Ед/мл, а уровень специфических IgE-антител к A.fumigatus составлял 2,27 МЕ/мл (средний уровень). В посеве промывной жидкости из бронхов был получен рост A.fumigatus в 3 точках. Количество эозинофилов в периферической крови составляло 8%. Диагноз АБЛА подтверждён не был и антимикотическая терапия не проводилась.В 2012 году больному было проведено повторное аллергологическое и микологическое обследование. Уровень общего IgE составил 171 ед/мл. Динамики остальных показателей не наблюдалось. Диагноз АБЛА подтверждён также не был и антимикотическая терапия не проводилась.

Клинический пример 2.

Больная П., 7 лет, жаловалась на длительный кашель. Уровень общего IgE составлял 475 Ед/мл. При аллергологическом обследовании с использованием MAST-панели на 36 аллергенов была выявлена поливалентная сенсибилизация, в том числе к грибам рода Aspergillus (++),  аллергия к пыльце берёзы (++), полыни (++), шерсти собаки (++), домашней пыли (+). Для проверки, не обусловлена ли поливалентная сенсибилизация высоким уровнем неспецифического сигнала, было назначено дополнительное аллергообследование с использованием тест системы «АллергоИФА-специфические IgE». С помощью этой тест системы компании «Алкор Био» было установлено, что у ребёнка имеется низкий (0,6 МЕ/мл) уровень специфических к A.fumigatus IgE, что по совокупности лабораторных и клинических данных не позволяет установить диагноз АБЛА на момент обследования и следовательно, нет необходимости лечения антимикотическими препаратами.

Следует отметить, что аномально высокий уровень фонового сигнала не характерен для сывороток больных муковисцидозом, а является индивидуальной особенностью сыворотки пациента на момент взятия крови. Приведенный клинический случай ярко иллюстрирует более высокую специфичность тест-систем, в основе которых лежит «capture»-вариант иммуноферментного анализа. Мы рекомендовали биотинилированные аллергены и наборы “АллергоИФА-специфические IgE” к использованию в практике клинико-диагностических лабораторий.

Литература

1.      Arbes S. J., Jr, Gergen P. J. et al.  Prevalences of positive skin test responses to 10 common allergens in the US population: results from the Third National Health and Nutrition Examination Survey //J. Allergy Clin. Immunol. – 2005.- V.116. - №2. – Р.377-383.

2.      Cuevas M, Moneo I. et al.   Reverse enzyme immunoassay for the determination of Lolium perenne IgE antibodies. //Int. Archs. Allergy Appl. Immunol. – 1983. V.72.- P.184–187.

3.      Plebani A., Ugazio A.G. et al.  An enzyme linked immunosorbent assay for cow’s milk protein-specific IgE using biotinylated antigen. Avoidance of interference by specific IgG. //J. Immunol.Meth. – 1986. – V.90. – P.241–246.

4.      О.В.Аак, А.В.Соболев. Сравнение набора реагентов «АллергоИФА-специфический IgE» и биотинилированных аллергенов ООО «Компании Алкор Био» с MAST-CLA  Hitachi Chemical Diagnostics для определения специфических IgE у больных атопическими заболеваниями.//Справочник заведующего КДД. – 2011.- №9. – С.40-44.