Статьи

19 июня 2014

ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА АЛЛЕРГОКОМПОНЕНТОВ БЕЛКА ЯЙЦА

РОССИЙСКАЯ АССОЦИАЦИЯ АЛЛЕРГОЛОГОВ И КЛИНИЧЕСКИХ ИММУНОЛОГОВ (РААКИ)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР «ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА»

Труды Международного форума, 14—17 мая 2014 г., Казань

c 237-238

Сейлиева Н. А., Верлыго Е. А.

ООО «Вега» Группа Компаний «Алкор Био», г. Санкт-Петербург

PURIFICATION AND PROPERTIES OF EGG WHITE ALLERGEN COMPONENTS

Seylieva N. A., Verlygo E. A.

Vega Ltd. Group of Companies «Alkor Bio»

Пищевая аллергия — это клинические проявления повышенной чувствительности организма к пищевым агентам, в основе которых лежат иммунологические механизмы. Эта проблема серьезно влияет на качество жизни примерно 4% детей и их семей по всему миру. Большая часть пищевой аллергии опосредована иммуноглобулином E и характеризуется реакцией гиперчувствительности первого типа. Как правило, IgE-зависимые реакции развиваются через 2 часа после приема пищи с широким спектром симптомов, от легких реакций, таких как зуд или крапивница, до таких серьезных, угрожающих жизни состояний, как анафилактический шок. Распространенность пищевой аллергии составляет не менее 1–2% и не более 10% в общей популяции [1].

Диагностика пищевой аллергии основана на данных анамнеза в сочетании с кожными тестами и/или in vitro тестировании. Тест in vitro заключается в измерении уровня иммуноглобулина класса Е (IgE) к специфическим антигенам по принципу иммунохимического анализа. Несмотря на широкое распространение и высокую чувствительность, данный тест имеет существенные недостатки, например, невысокую специфичность анализа, наличие расхождений с результатами кожных проб, наличие положительных результатов тестирования при отсутствии чувствительности и т. д. [2]. Основным источником такого рода проблем является применение в диагностических тест-системах экстрактов, полученных из природных источников. Экстракты представляют собой сложные смеси, содержащие в составе помимо аллергенных белков, неактивные белки и другие балластные вещества. Причём активные аллергенные белки зачастую являются всего лишь минорным компонентом суммарной белковой фракции. Очевидно, что такие экстракты плохо поддаются стандартизации из-за их различий в химическом составе природного сырья и методах получения экстрактов. Кроме того, аллергенные белки, выделенные из различных природных источников, (пыльца, фрукты, шерсть животных и т. п.), могут иметь сходную структуру, а значит, вызывать схожие аллергические реакции. Такая кросс-реактивность также затрудняет точную идентификацию источника аллергической реакции и постановку диагноза. Значительно улучшить специфичность и другие аналитические параметры существующих тест-систем для in vitro аллергодиагностики может применение вместо суммарных белковых экстрактов индивидуальных аллергенных белков, так называемых, аллергокомпонентов [3]. Такие индивидуальные аллергенные белки могут быть получены как путем выделения из природных источников (натуральные высокоочищенные аллергены), так и при помощи молекулярно-биологических методов (рекомбинантные аллергены) [4]. Следует отметить, что индивидуальные аллергокомпоненты представляют также большой интерес для аллергоспецифической иммунной терапии (АСИТ) [5].

Ранее в группе компаний «Алкор Био» начаты работы, направленные на создание панели индивидуальных аллергокомпонентов и тест-систем для аллергодиагностики in vitro на их основе [3, 4]. Целью данной работы являлось получение аллергокомпонентов белка яйца и исследование их иммунологических свойств. Известно, что яйца являются важным компонентом в питании человека и в то же самое время одним из основных пищевых аллергенов [6–]. Среди обследованных детей с атопическим дерматитом около 35,5% имеют аллергию к яйцу, тогда как среди взрослых с аллергией к пище около 12% реагируют на яйца [9]. В настоящее время описаны 4 аллергена яичного белка: овальбумин (Gal d 2, 54% от общего белка яйца), кональбумин, также известный под названием овотрансферрин (Gal d 3, 12%), овомукоид (Gal d1, 11%) и лизоцим (Gal d 4,3%) [10]. Суммарно эти аллергокомпоненты составляют около 80% от общего белка [10]. Следует отметить, что овальбумин и овомукоид относятся к термостабильным белкам и сохраняют свои аллергенные свойства даже после термической обработки яйца. В аллергодиагностике овомукоид- и овальбумин-специфические IgE рекомендованы к применению в качестве маркеров аллергии к приготовленному яйцу, что позволяет врачу определить необходимость назначения строгой диеты [11]. Лизоцим широко используется как антибактериальная добавка в пищевой промышленности и может являться причиной пищевой аллергии [10].

На первом этапе исследования водный раствор белка яйца был подвергнут разделению с помощью жидкостной анионообменной хроматографии (Akta Explorer Air 100, GE Healthcare Inc). В результате была выделена фракция, содержащая овальбумин, кональбумин и овомукоид. Последующая разделение с помощью катионобменной хроматографии позволила выделить индивидуальный кональбумин, а также фракцию, содержащую овальбумин и овомукоид. Отделение овомукоида от овальбумина проводили осаждением трихлоруксусной кислотой по стандартной методике. Лизоцим выделяли из водного экстракта с помощью гель-фильтрационной хроматографии. Состав полученных фракций и степень их очистки анализировали на электрофорезе относительно референсных белков (Indoor biotechnologies).Изучение иммунологических свойств полученных белков было выполнено на индивидуальных сыворотках крови 18 пациентов с помощью набора «АллергоИФА-специфические IgE» (ООО «Компания Алкор Био»). Контрольные сыворотки, не имеющие аллерген-специфических IgE к яйцу (препарат f245, Phadia), а так же референсные сыворотки с повышенным уровнем аллерген-специфических IgE к компонентам белка яйца (препараты f233, f232 и k208, Phadia) были охарактеризованы при помощи анализатора Phadia 100 (Phadia).

В ходе проведенного анализа для компонентов овальбумин (Gal d 2) и лизоцим (Gal d 4) показаны 100% чувствительность и специфичность. Для компонента овомукоид (Gal d 1) показаны 100% специфичность и незначительное расхождение в чувствительности, не превышающее 1 класс. Аллергокомпонент кональбумин (Gal d 3) в настоящее время проходит тестирование иммунологических свойств. Таким образом, нами были получены аллергокомпоненты яйца овомукоид, овальбумин и лизоцим, подтверждены их иммунологические свойства, что позволяет использовать их для определения специфических IgЕ в образцах сыворотки крови. В настоящее время ведутся работы по выделению и расширению панели аллергокомпонентов.

Литература

  1. Chafen J.J., Newberry S.J., Riedl M.A., et al. Diagnosing and managing common food allergies: a systematic review. JAMA. 2010,  v. 303, p. 1848–56.
  2. А. Е. Павлов, Н. А. Сейлиева, В. Е. Стефанов. Перспективы развития молекулярной диагностики аллергии в формате микрочипа. Клиническая лабораторная диагностика, 2011, №12, с. 3-7.
  3. Kattan J.D., Wang J. Allergen component testing for food allergy: ready for prime time? 2013, v.13, p. 58-63.
  4. А.Е.Павлов, Н.А.Сейлиева, О.Ю.Мухортых, В.Е. Стефанов. Получение и оценка свойств рекомбинантного аналога мажорного аллергена пыльцы березы Betv 1. Российский аллергологический журнал, 2012, №3, с. 7-13.
  5. Asero R. Component-resolved  diagnosis-assisted prescription of allergen-specific immunotherapy: a practical guide. Eur. Ann. Allergy Clin. Immunol. 2012, v. 44, n.5, p. 183-187
  6. Zukiewicz-Sobczak W.A., Wróblewska P., Adamczuk P., Kopczyński P. Causes, symptoms and prevention of food allergy. Postepy Dermatol. Alergol. 2013, v. 30, p. 113-116.
  7. Rona R.J., Keil T., Summers C., et al. The prevalence of food allergy: a meta-analysis.  J. Allergy Clin. Immunol. 2007, v. 120, p. 638–646.
  8. Yunginger J.W. Classical food allergens. Allergy Asthma proc. 1990, v. 11, 7-9.
  9. Wüthrich B. Lethal or life-threatening allergic reactions to food. J. Invest. Allergy Clin. Immunol. 2000, v. 10, p. 59-65.

10.  Mine Y., Yang M. Recent advances in the understanding of egg allergens: basic, industrial, and clinical perspectives. J. Agric. Food Chem. 2008, v. 56, p. 4874–4900.

11.  Ando H., Movérare R., Kondo Y., et al. Utility of ovomucoid-specific IgE concentrations in predicting symptomatic egg allergy. J. Allergy Clin. Immunol. 2008, v. 122, p. 583–588.