Статьи

16 апреля 2018

Диагностика ToRCH-инфекций методом ИФА. Особенности определения ЦМВ IgM

Статья опубликована в журнале "Ремедиум" (Приволжье), март 2018

Крылова О.Н., руководитель направления «Инфекционная диагностика» ГК Алкор Био

ToRCH-инфекции – это внутриутробные инфекции (ВУИ) плода, к которым относятся, прежде всего, токсоплазмоз, краснуха, цитомегаловирусная инфекция (ЦМВ) и герпесвирусная инфекция. Во всем мире проблема диагностики и профилактики ToRCH-инфекций актуальна и успехи современной медицины очевидны.

В России основным скрининговым методом диагностики ToRCH-инфекций на сегодняшний день является иммуноферментный анализ (ИФА). ИФА позволяет определять наличие антител и степень их созревания.

Остановимся более подробно на тест-системе для определения иммуноглобулинов класса М(IgM). Это важный тест, так как присутствие IgM дает возможность выявить период острой фазы инфекции. Но это и самый сложный в исполнении тест.

Клинико-диагностические лаборатории в настоящее время сталкиваются на практике с двумя проблемами - большое количество  полученных ложноположительных  и  ложноотрицательные результатов. Рассмотрим возможные причины низкой чувствительности и специфичности тестов на примере теста ЦМВ  IgM.

Прежде всего, диагностическую специфичность тест-систем снижают иммуноглобулины класса G(IgG), которые присутствуют в крови пациентов после перенесенной инфекции. По размеру IgG меньше, чем  IgM и могут успешно конкурировать  за связывание с антигеном. Также на специфичность может негативно влиять ревматоидный фактор: он способен образовать схожий с IgM комплекс  и мешает выделению IgM. Третьей причиной снижения специфичности тест-систем IgM  ЦМВ традиционно считаются перекрестные реакции. Герпесвирусы  эволюционно родственны ЦМВ и имеют с ним множественные общие антигенные детерминанты (1).

Для получения точных результатов определения IgM причины возникновения низкой специфичности должны быть исключены.

Для наиболее эффективного выявления IgMслужит capture-метод. Прогрессивные  российские производители в тест-системах определяют IgM обязательно capture-методом.

И это вполне обосновано. Суть capture-метода в том, что в качестве иммуносорбента в лунки планшета нанесены  не обычные антигены, а антитела против µ-цепей IgM. Такие антитела высоко специфичны к IgM, поскольку ориентированы на консервативный район тяжелой µ-цепи IgM. Конкурирующие IgG и ревматоидный фактор не могут выявляться этим методом, так как аминокислотная последовательность консервативного района тяжелой Y-цепи (уникальной для IgG) отличается от аналогичной последовательности µ-цепи.

Исключить перекрестные реакции позволяют конъюгированные антигены цитомегаловируса. Специфический антиген входит в состав конъюгатов российских и зарубежных разработчиков. Однако, наиболее полно решить проблему перекрестных инфекций позволяет решить лиофилизат антигена  ЦМВ, который вносится в биотинилированный конъюгат непосредственно перед инкубацией.

Данная технология реализована  в тест-системе бренда Radim (владелец РУ РФ  ГК Алкор Био), что положительно сказалось на специфичности теста. Диагностическая специфичность тест-системы «Цитомегаловирус IgM»Radim составляет 100%, в представленном методе отсутствуют и влияние ревматоидного фактора, и IgM других вирусов герпеса (вируса Эпштейна-Барр, вируса ветряной оспы и вируса простого герпеса).

Постановка теста в такой модификации полностью избавляет от ложноположительных результатов.

Обращая ещё раз внимание на сложность определения  IgM, не нужно забывать и о балансе между чувствительностью и специфичностью. На практике часто Сapture обеспечивает высокую специфичность, но не во всех тест-системах дает оптимальную чувствительность.

В последнее время в лабораторной диагностике существует модный тренд – короткое время постановки теста. Действительно, российские производители конкурируют между собой за продолжительность инкубаций.

Но в погоне за коротким временем постановки нередко страдает чувствительность, ведь именно многостадийность теста положительно влияет на его чувствительность.

Обращаясь к основам классики (2), хочется рассмотреть варианты инкубаций с конъюгатами более подробно. 

В качестве конъюгата  используется система биотин-стрептавидин, дающая дополнительные участки связывания. Инкубация может быть одностадийной или в два этапа. При  двухстадийных инкубациях с конъюгатами всегда идет значительное увеличение ковалентных связей, что ведет к усилению сигнала, т.е. значительному повышению чувствительности теста. Две последовательные инкубации (с биотином, а затем со стрептавидином) представлены в тест системах  IgM  ToRCH-инфекций бренда Radim .

Заключение:

Множественные варианты формата анализа, основанного на связывании и детекции антител класса IgM  ToRCH-инфекций (в том числе ЦМВ) могут быть скомбинированы в различные методики. Тест, соответствующий требованиям высокой чувствительности и специфичности, может применяться в соответствии с общей клинической картиной для достижения достоверного результата. Но определение наиболее эффективного метода всегда нужно поручить практике.  Тест-системы бренда Radim на протяжении многих лет используются экспертными лабораториями как образец точных тестов.

Литература:

1. «Использование разных форматов методов серологического определения антиген-специфического IgM при диагностике инфекционных заболеваний» Чарлз Ли, Мина Гадеши, Деннис Састерсик, Рома Леви. 2005 г.

2. «Моноклональные антитела» Наталья Кузьмина.